二者的区别有以下几点：
一、对应软件版本的不同
.xls文件扩展名对应的是Microsoft Office EXCEL 2003及以前的版本。
.xlsx文件扩展名对应的是Microsoft Office EXCEL 2007及后期的版本。
二、在核心结构上的区别：
.xls文件是一个特有的二进制格式，其核心结构是复合文档类型的结构。
.xlsx文件的核心结构是 XML 类型的结构，采用的是基于 XML 的压缩方式，使其占用的空间更小。
三、二者对于软件兼容方面的不同
.xls文件既可以用Office EXCEL 2003版本打开，也可以用Office EXCEL 2007及后期的版本打开。
.xlsx文件只能用Office EXCEL 2007及后期的版本打开，Office EXCEL 2003版本是使用不了.xlsx格式的文件的。如果要用Office EXCEL 2003版打开.xlsx文件，可以安装Office兼容性补丁包，通过应用兼容性补丁包，Office EXCEL 2003的用户可以打开、编辑、保存.xlsx格式的文档。
此兼容性补丁包也能结合Office Word Viewer 2003，Excel Viewer 2003和PowerPoint Viewer 2003使用来浏览用新格式保存的文件。
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