人类基因组概况：
人类基因组由ATCG四种碱基组成，但是CG的含量低于50%，所以CG含量低于AT含量。
一个基因组的dna大约3ug。
snp：
平均每100到1000个碱基会出现1个SNPs，不过密度并不均匀。
如果按照每1000个碱基存在1个SNP来计算，人类30亿个碱基中，大约有300万个SNPs。
人类基因组的突变频率10的-6次方。即：每10的6次方个碱基，就会发生一个突变。
基因组长度：
人类基因组有30亿个碱基（3*10的10次方）。人类基因组的exon的长度大约1*10的7次方，占基因组的2%~3%。
假如平均一个protein的长度为500个amino acid（氨基酸），那么编码一个protein需要的碱基数为500*3=1500bp=1.5kb。那么，1个protein占exon的碱基数：1500/（1*10的7次方）≈10的4次方，即1个protein占exon碱基数的万分之一。
基因类型：
Ensemble数据库中有5万多个基因。其中，2万多个蛋白编码基因，还有假基因、microRNA、LincRNA等。GeneCode的gtf文件中，有一列是genetype，它分的类型是：protein coding、LincRNA、假基因。
即：基因可分为两大类编码蛋白的基因（包括：protein coding gene、pseudogene、LincRNA）、不编码蛋白的基因。
基因区域：
UTR：不翻译成蛋白。 3`UTR：转录起始->翻译起始（ATG）之间的区域。5`UTR：翻译终止->转录终止之间的区域。
阅读框：开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)从DNA序列中，从起始密码子开始，到终止密码子结束的一段具有编码蛋白质功能的碱基序列。
intergenic：DNA不转录成RNA的区域。落入该区域的突变，不知道功能、不关注、不找hotspot。人类基因组98%是intergenetic区域。
introgenic：DNA转录成RNA的区域，包括：upstream，intron，exon，downstream，non-coding RNA，lincRNA。只关注落入introgenic区域的突变。即：只关注能转录成RNA的区域内的突变。
基因突变：
1. 突变类型：
non-sense（无义突变）：某个碱基突变后，导致原本编码氨基酸的密码子变成了终止密码子，使肽链合成提前终止。
FrameShiftIndel：在阅读框内发生的indel。突变发生的位置不是3的倍数，导致碱基序列在翻译成氨基酸的过程中乱套了。
missense：错义突变。导致编码的氨基酸发生变化。
VTR_INTRON_ncRNA：exon之外的区域发生突变。
synonymous：碱基发生改变。但编码的氨基酸不变，不会对形成的蛋白有影响。比如：CTA与CTG 均编码亮氨酸，若A突变为G则该变异为同义突变。
silent：碱基发生改变，而编码的氨基酸也发生改变，但不影响蛋白质的编码。
2. 突变频率（variant allele frequency，VAF）：
假如某个snv点的VAF为0.125=12.5%，这表示：在覆盖这个点的read数中，有12.5%的read来自B allele（即突变的那条allele），由此可以得出：25%的肿瘤细胞携带B allele。参照下图。
等位基因频率（也称为：B allele frequency）：10万人，9万人携带的的是geneA，1万人携带的是geneB。则，等位基因频率为：1/10=10%。
3. 突变注释的工具：
snpEff。注释snv的工具。
4. 突变原因：
G->T：氧化损伤导致 G->A（C->T）：脱氨基导致
5. 非编码蛋白突变的解释：
同义突变，虽然对这个基因编码的蛋白没有影响。但是，会影响其他基因的表达。比如，APC有4个同义突变，这些突变会影响REEP5（它是一个tumor suppressor gene）的RNA表达值。
6.基因的拷贝数变异：
通常call CNV的工具会考虑的因素：normalization、纯度、污染度、倍系。
疑问1：肿瘤病人的正常组织（如：OEC），或者正常人血液中的白细胞，对这些样本进行靶向测序时，为什么有大量snp的突变频率会在10%~30%之间呢？正常snp的突变频率应该是50%或100%。
推测原因：（1）PCR扩增的偏好，也可称为抽样误差。比如：该snp（A-》G，A突变为G）的突变频率应该是50%，但是，由于扩增的偏好性，导致A allele被大量扩增，G allele扩增的少。
那么，假设携带正常A的allele被测了8，携带突变G的 allele被测了2次，则计算得到的G的allele frequency为2/10=20%。
（2）因为是靶向测序，所以有可能是此位点被不同的amplicon覆盖。而amplicon在PCR扩增过程中会引起错误。
（3）基因组在此snp位置处存在拷贝数异常的现象。
（4）基因存在多拷贝的情况。比如，gene A在基因组中存在多个。
（5）纯度所致。
（6）这些snp是否有组织特异性呢？在不同的组织中，存在这种状况的snp有差异吗？比如，某个snp在OEC中突变频率是20%，而在WBC中是50%。存在这样的情况吗？
没有验证这种想法。
疑问2：肺癌病人的OEC与白细胞的靶向测序结果中，存在大量不一致的snp。因为所有细胞的DNA序列都是一致的，为什么会出现这样的情况呢？
后来，我在查阅脑细胞somatic mutation时，看到一篇文献说：其实各个组织中的基因组是不一致的。
疑问3：WGS的测序数据中，也存在很多这样的突变频率在10~30%之间的snv or snp。增加测序深度后，这样的snv占的比例反而更高呢？这是为何呢？
这说明，这样的snv是真实存在的，测序深度越高，越能检测到更多这样的snv。
因为是在肿瘤样本，所以，这样的突变可以用肿瘤组织的clone原理来解释。即：肿瘤细胞可以被分为不同的群体，有一些群体携带这样的snv，而其他的群体不存在这样的snv。这又是为何呢？因为携带这些snv的细胞群体是在肿瘤形成过程的后期出现的。
但是，这个问题在测序深度很深时，应该会避免。因为大数据量时，会避免抽样误差。结果呢？进行上万层的测序时，仍然存在这个问题。
重复序列：
LINE：重复序列。大脑发育过程中LINE很活跃。LINE通过反转录的方式，插到其它序列中。
6.7kb。转录成长的RNA，编码反转录酶，将自己或其它序列插入到DNA中。
tanderm repeat：
repeatMaster工具，可发现基因组上的重复序列。
熟悉的基因：
abparts（BCR，B cell receptor）：B cell抗原受体。作用是识别抗原。编码B cell抗体的基因。B cell在骨髓中淋巴细胞中重排。
一个B cell携带一个抗体。
一般的染色体重排只发生在一条染色体上，但是，chrom14的abparts，在两条染色体上都发生了重排。
TCR（Tcell receptor ）：T cell抗原受体。作用是识别抗原。编码T cell抗体的基因。分两种TCR1和TCR2，外周血中主要是TCR2。
RB1：与细胞周期有关的一个基因。抑制磷酸化，抑制细胞增殖。
RCBTB2：在胞质中存在。与染色质浓缩有关。